Lindl Zell- und Gewebekultur

5. Auflage 2002
ISBN: 978-3-8274-1194-5
Verlag: Spektrum Akademischer Verlag
Format: PDF
Kopierschutz: Adobe DRM (»Systemvoraussetzungen)

E-Book, Deutsch, 329 Seiten

"Dieses Methodenbuch zur Zell- und Gewebekultur soll Biologen, Medizinern, Pharmazeuten, Biotechnologen und technischen Assistenten die tägliche Laborroutine erleichtern. Neben der Vermittlung wissenschaftlicher Grundlagen und gesetzlicher Richtlinien sind es vor allem die leicht nachvollziehbaren ""Man-nehme""-Vorschriften, die den praktischen Wert des Buches ausmachen. Exemplarisch werden die wichtigsten Grundoperationen in der Zellkultur behandelt, so dass auch weniger mit der Kultur tierischer und pflanzlicher Zellen Vertraute sich gut mithilfe des Buches einarbeiten können. Der Info-Anhang enthält stöchiometrische Rechenbeispiele, ein umfangreiches Glossar, weiterführende Literaturhinweise und Adressen von Lieferfirmen mit Internetadressen.

In der 5. aktualisierten Auflage sind moderne Ansätze in der dreidimensionalen Zellkultur und in der Stammzellforschung hinzugekommen. Als sehr hilfreich werden sich die erweiterten Tipps und Lösungsvorschläge zum ""Trouble Shooting"" erweisen, sie stehen jetzt - extra gekennzeichnet - in direktem Zusammenhang bei den jeweiligen Methoden bzw. Themen.

Außerdem enthält diese Auflage erstmals Vorschriften zum Toxizitätsscreening embryonaler Stammzelllinen der Maus samt Differenzierungsansätzen hierfür. Sie sind zur Unterstützung der ""good cell culture practice"" in Form einer so genannten SOP (""standard operation procedures"") gehalten. Hierbei geht es um die verlässliche Nachvollziehbarkeit von Methoden und Ergebnissen, was für die Praxis der Zellkultur ein besonderes Anliegen dieses Buches ist.

Der Autor

Prof. Dr. Toni Lindl ist Dozent an der TU München (Weihenstephan) und Inhaber der Firma ""Institut für angewandte Zellkultur""."  

Autoren/Hrsg.

Lindl, Toni

Inhaltsverzeichnis

1;Vorwort zur 5. Auflage;8
2;Inhalt;10
3;1 Räumliche und apparative Voraussetzungen, Sicherheitsvorschriften;14
3.1;1.1 Der Reinigungsbereich;14
3.2;1.2 Der Vorbereitungs- und Verarbeitungsbereich;15
3.3;1.3 Der Sterilbereich;16
3.4;1.4 Sicherheitsvorschriften und Entsorgung;30
3.5;1.5 Generelle Probleme;33
3.6;1.6 Literatur;34
4;2 Kulturgefäße und ihre Behandlung;36
4.1;2.1 Züchtung von Zellen auf Glas;36
4.2;2.2 Züchtung von Zellen auf Plastikmaterial;37
4.3;2.3 Züchtung von Zellen auf anderen Materialien;41
4.4;2.4 Spezielle Kulturgefäße;42
4.5;2.5 Reinigung und Vorbehandlung von Glaswaren;46
4.6;2.6 Vorbehandlung von Kulturgefäßen mit Substanzen zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften;50
5;3 Steriltechnik – Kontaminationen;54
5.1;3.1 Der Sterilbereich;55
5.2;3.2 Laborreinigung;56
5.3;3.3 Hygiene;56
5.4;3.4 Aseptische Arbeitstechnik;56
5.5;3.5 Sterilisationsverfahren;61
5.6;3.6 Antibiotika;71
5.7;3.7 Mycoplasmen;74
5.8;3.8 Kreuzkontaminationen;84
5.9;3.9 Literatur;85
6;4 Zellkulturmedien;86
6.1;4.1 Herstellung gebrauchsfertiger Medien;86
6.2;4.2 Anmerkungen zu einigen Rezepturen;90
6.3;4.3 Serumfreie Medien;94
6.4;4.4 Zusätze zu Medien;102
6.5;4.5 Reinstwasser für Zell- und Gewebekulturen;108
6.6;4.6 Literatur;112
7;5 Routinemethoden zur allgemeinen Handhabung und Subkultivierung von Zellen;114
7.1;5.1 Mediumwechsel;114
7.2;5.2 Subkultivierung von Monolayerkulturen;117
7.3;5.3 Subkultivierung und Suspensionskulturen;122
7.4;5.4 Zellzahlbestimmung;123
7.5;5.5 Langzeitlagerung und Kryokonservierung von Zellen;128
7.6;5.6 Versand von Zellen;133
7.7;5.7 Probleme mit Zellen;133
7.8;5.8 Literatur;134
8;6 Primärkulturen;135
8.1;6.1 Kultivierung von Herzmuskelzellen des Hühnchens;136
8.2;6.2 Kultivierung von Herzmuskelzellen aus neonatalen Rattenherzen;138
8.3;6.3 Primärkulturen aus frischen Hautproben (Biopsien) menschlichen Ursprungs;139
8.4;6.4 Isolierung von Lymphocyten aus Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation;140
8.5;6.5 Primärkulturen aus Mäusecerebellum (Kleinhirn);142
8.6;a;142
8.7;c;142
8.8;6.6 Gewinnung einer Zellkultur aus soliden Humantumoren;144
8.9;6.7 Gewinnung von Keratinocyten;146
8.10;6.8 Humane adhärente Zelllinien;150
8.11;6.9 Literatur;150
9;7 Organkulturen;153
9.1;7.1 Präparation eines Säugerdünndarms als Beispiel für eine Organpräparation in der Pharmakologie;156
9.2;7.2 Präparation eines peripheren Nerven (oberes Halsganglion) zur Messung der neuronalen Übertragung ( Neurotransmission);158
9.3;7.3 Leberschnitte in vitro;160
9.4;7.4 Literatur;163
10;8 Kultur spezieller Zelltypen;164
10.1;8.1 Hybridomzellen;164
10.1.1;8.1.1 Prinzipieller Verfahrensablauf;164
10.1.2;8.1.2 Antigene und Adjuvantien;166
10.1.3;8.1.3 Tierwahl für die Immunisierung;166
10.1.4;8.1.4 Immunisierung;166
10.1.5;8.1.5 Kultur der Myelomzellen;166
10.1.6;8.1.6 Konditionierte Medien und „feeder“-Zellen;168
10.1.7;8.1.7 Elektrofusion von Zellen;170
10.1.8;8.1.8 Screening tierischer Hybride;173
10.2;8.2 Hepatocyten;174
10.3;8.3 Phäochromocytomzellen PC 12;178
10.4;8.4 Endothelzellen;179
10.5;8.5 Dreidimensionale Zellkultur;184
10.6;8.6 Literatur;187
11;9 Die Massenkultur;190
11.1;9.1 Monolayer-Kulturen für große Zellmengen;191
11.1.1;9.1.1 Roller-Kultur;192
11.1.2;9.1.2 Wannen-Stapel (multi-tray, cell factory);192
11.1.3;9.1.3 Kapillar-Perfusion (Kapillarreaktor, Dialysator);192
11.1.4;9.1.4 Microcarrier-Kultur (Mikroträger);193
11.2;9.2 Suspensionskultur für große Zellmengen;196
11.2.1;a;197
11.2.2;b c;197
11.2.3;9.2.1 Flasche (Celline) mit Silikonmembran für Suspensionskulturen hoher Dichte;198
11.3;9.3 Literatur;198
12;10 Zellkulturen aus Geweben von Invertebraten und kaltblütigen Vertebraten;199
12.1;10.1 Invertebraten;199
12.1.1;10.1.1 Temperatur;199
12.1.2;10.1.2 Atmosphäre;199
12.1.3;10.1.3 Medien;199
12.1.4;10.1.4 Subkultur;200
12.1.5;10.1.5 Suspensionskultur;200
12.1.6;10.1.6 Aufbewahrung und Lagerung;202
12.2;10.2 Kaltblütige Vertebraten;203
12.2.1;10.2.1 Fischzellkulturen;203
12.3;10.3 Literatur;204
13;11 Pflanzenzellkulturen;206
13.1;11.1 Herstellung von Kulturmedien;206
13.2;11.2 Kalluskultur aus teilungsfähigem Pflanzengewebe;210
13.3;11.3 Pflanzenzellkulturen als Suspensionskulturen;214
13.4;11.4 Isolierung von Einzelzellen und Protoplasten aus Pflanzenzellkulturen;215
13.5;11.5 Elektrofusion von Pflanzenprotoplasten;217
13.6;11.6 Fusion von Protoplasten mittels Polyethylenglykol;217
13.7;11.7 Antherenkultur;220
13.8;11.8 Embryonenkultur;223
13.9;11.9 Einfrieren von Pflanzenzellsuspensionen;224
13.10;11.10 Literatur;226
14;12 Spezielle Methoden der Zellbiologie;227
14.1;12.1 Versuche zur In-vitro-Toxizität;227
14.1.1;12.1.1 Zellkulturmethoden;228
14.1.2;12.1.2 Konzentration der applizierten Substanz in vitro und zeitlicher Verlauf der Applikation;229
14.1.3;12.1.3 Erholungsperiode;230
14.1.4;12.1.4 Endpunkte;230
14.2;12.2 Methoden zur In-vitro-Toxizitätsprüfung;233
14.2.1;12.2.1 Prüfung auf wachstumshemmende Eigenschaften einer Substanz;233
14.2.2;12.2.2 Prüfung auf akute Zelltoxizität;235
14.2.3;12.2.3 Vitalfärbung zur Testung auf Lebensfähigkeit von Zellen;238
14.2.4;12.2.4 MTT-Test zur Messung von Lebensfähigkeit und Wachstum;239
14.2.5;12.2.5 Nachweis mutagener Substanzen;240
14.3;12.3 Transfektion;241
14.3.1;12.3.1 Transfektion nach der Calciumphosphatmethode;241
14.3.2;12.3.2 Transfektion mittels Elektroporation;243
14.3.3;12.3.3 Lipofektion in nicht-adhärenten Zellen;245
14.4;12.4 Klonierung;246
14.4.1;12.4.1 Limited-Dilution-Klonierung;246
14.4.2;12.4.2 Klonierung in Weichagar;247
14.4.3;12.4.3 Isolierung von adhärenten Zellklonen;249
14.5;12.5 3H-Thymidineinbau als Proliferationskontrolle;250
14.6;12.6 Inhibition des Zellwachstums (quantitative Neutralrotmethode);251
14.7;12.7 Ermittlung der Anheftungseffizienz („plating efficiency“);252
14.8;12.8 Virusvermehrung und Transformation mit Epstein-Barr-Viren ( EBV);254
14.9;12.9 Populationsverdopplungszeit;256
14.9.1;12.9.1 Populationsverdopplungszeit bei Suspensionskulturen;257
14.10;12.10 Zellsynchronisation;257
14.10.1;12.10.1 Zellsynchronisation durch Abkühlen;257
14.10.2;12.10.2 Zellsynchronisation durch Schütteln;257
14.10.3;12.10.3 Zellsynchronisation durch Colcemid-Block;258
14.10.4;12.10.4 Zellsynchronisation durch Serumentzug;259
14.10.5;12.10.5 Zellsynchronisation durch Isoleucinmangel;259
14.11;12.11 Cytometrie;260
14.11.1;12.11.1 Klonierung von Zellen mittels eines FACS;262
14.11.2;12.11.2 Bestimmung der Zellzykluszeit einer proliferierenden Population mittels Bromdesoxyuridineinbaus;264
14.11.3;12.11.3 Bestimmung von verschiedenen Subpopulationen aus peripheren Humanleukocyten;266
14.12;12.12 Chromosomenpräparation;267
14.13;12.13 Literatur;269
15;13 Stammzellen;271
15.1;13.1 Gewinnung und Kultur hämatopoetischer Stammzellen;271
15.2;13.2 Embryonaler Stammzell-Test (EST) (Spezies: Maus);277
15.2.1;13.2.1 Grundlegende Verfahren;278
15.3;13.3 Dezimale geometrische Konzentrationsreihen;289
15.4;13.4 Löslichkeit der Testchemikalien;290
15.5;13.5 Literatur;291
16;14 Kleines Zell- und Gewebekulturlexikon;292
16.1;14.1 Literatur;306
17;15 Anhang;307
17.1;15.1 Was kann die Ursache von schlechtem Zellwachstum sein?;307
17.2;15.2 Berechnungen in der Zellkultur;308
17.3;15.3 Nachschlagewerke und Handbücher der Zell- und Gewebekultur;311
17.4;15.4 Zeitschriften;313
17.5;15.5 Literaturdienst;313
17.6;15.6 Institutionen und Firmen, die Zellkulturkurse durchführen;313
17.7;15.7 Wissenschaftliche Gesellschaften für Zellkultur;314
17.8;15.8 Übersichtswerke zur Beschaffung von Geräten, Labormaterial und Reagenzien;314
18;16 Lieferfirmen und Hersteller;315
19;Index;323
20;Mehr eBooks bei www.ciando.com;0

Leseproben

1.3 Der Sterilbereich (S. 3-4)

Dieser Bereich, in dem die eigentlichen Arbeiten an den Zellkulturen durchgeführt werden, ist so sparsam wie möglich auszustatten, um nicht unnötigerweise Platz und Ecken für Kontaminationsmöglichkeiten zu schaffen. Hier sollten nur die sterile Werkbank, der Brutschrank, ein Wasserbad, eine Zentrifuge, ein Umkehrmikroskop und Schränke für die Aufbewahrung von sterilen Gebrauchsgegenständen vorhanden sein. Dazu kommen allgemeine Einrichtungen wie Waschbecken, Gasanschluss und ausreichende Beleuchtung.

1.3.1 Die sterile Werkbank

Die sterile Werkbank, auch Reinraumwerkbank oder Sicherheitswerkbank genannt, ist in dem Sterilbereich möglichst weit entfernt von der Tür aufzustellen. Eine solche Werkbank ist heute eine unbedingte Voraussetzungen zur erfolgreichen Zellzüchtung. Alle anderen Lösungen, wie Arbeiten im Abzug mit UV-Lampe u.Ä. sind unzureichend und schützen nicht zuverlässig vor Kontaminationen. Es gibt eine Vielzahl von Modellen verschiedener Firmen, die aber prinzipiell zwei Typen zuzuordnen sind: Bei der sterilen Werkbank mit horizontaler Luftströmung wird die Luft in der Regel zunächst durch ein Hochleistungsschwebstofffilter (HOSCH-Filter, s. u.) gedrückt, das senkrecht an der Rückwand des Geräts montiert ist, und dann als sterile laminare Verdrängungsströmung horizontal über die Arbeitsfläche geführt (Abb. 1-3).

Diese Geräte sind keine Sicherheitswerkbänke im Sinne der DIN-Norm 12950: „Sicherheitswerkbänke für mikrobiologische und biotechnologische Arbeiten"". Sie dürfen daher für Arbeiten mit Gefährdungspotenzial nicht verwendet werden. Sie sind jedoch für Arbeiten ohne Gefährdungspotenzial durchaus geeignet, z.B. für sterile Präparationen unter einem Stereomikroskop, bei denen es zweckmäßig ist, wenn der Luftstrom herabfallende Partikel vom Präparat wegbläst. Diese Typenklasse ist auch geeignet für die Sterilfiltration ungefährlicher bzw. biologisch unbedenklicher Lösungen und Zubereitungen, wie Zellkulturmedien oder Serumfiltrationen. Die Werkbände sind einfach gebaut, wartungsarm und preisgünstig. Länger dauernde Arbeiten sind meistens unangenehm, weil dem Experimentator ständig Luft ins Gesicht bläst.

Bei der Reinraumwerkbank (Sicherheitswerkbank) mit vertikaler Strömung – zu diesem Typ gehören alle Sicherheitswerkbänke nach DIN 12 950 – wird die Luft entweder vertikal nach oben (Klasse 1) oder vertikal nach unten (Klasse 2) geleitet. Bei der Klasse 1 (Abb. 1-4a) wird die Raumluft ohne Filterung angesaugt und durch ein HOSCH-Filter nach oben in den Raum entlassen. Für steriles Arbeiten sind solche Werkbänke nicht geeignet."